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老年性黃斑變性（AMD）、視網(wǎng)膜色素變性（RP）等視網(wǎng)膜變性疾病是目前尚無有效治療手段的兇險致盲性眼病，也是公認的“視力殺手”。由中南大學愛爾眼科學院院長唐仕波教授、愛爾眼科研究所副所長陳建蘇教授帶領(lǐng)團隊，利用誘導多能干細胞（iPS）條件培養(yǎng)基和飛秒角膜透鏡，聯(lián)合構(gòu)建高活性視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）的研究，不但有利于對視網(wǎng)膜色素上皮細胞生理特性、藥物篩選等研究，還有利于構(gòu)建組織工程視網(wǎng)膜層及其移植。這將幫助科學家開發(fā)出應用組織工程RPE細胞片治療視網(wǎng)膜變性疾病和光感受器病變的新方法。
培養(yǎng)高活性的視網(wǎng)膜細胞
與年齡相關(guān)的老年性黃斑變性是發(fā)達國家50歲以上人群視力損害和致盲的首要病因，多達90%的病人無法治愈。數(shù)據(jù)顯示，發(fā)達國家年齡50歲以上黃斑變性的發(fā)病率達11%，目前我國的發(fā)病率接近發(fā)達國家，患病人數(shù)超過3000萬人，并以每年30萬人次的速度增加，成為我國現(xiàn)階段50歲以上年齡群體發(fā)病率最高的三大眼科疾病之一，而且女性呈現(xiàn)出比男性更高的危險性。
研究發(fā)現(xiàn)，未來最有希望治療老年性黃斑變性的方式是視網(wǎng)膜色素上皮細胞療法、視網(wǎng)膜黃斑部分的移植。那么，要采用RPE療法，就需要先培養(yǎng)健康的視網(wǎng)膜細胞。
陳建蘇告訴科技日報記者，取出死亡時間在3小時內(nèi)捐獻者的帶有部分脈絡膜的視網(wǎng)膜組織，在解剖顯微鏡下可將帶有部分脈絡膜的RPE層從捐贈組織中分離出來，并培養(yǎng)出RPE細胞?！氨狙芯客ㄟ^半定量蛋白芯片分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了包括血小板衍生生長因子AA（PDGF-AA）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP-2）等因子，在誘導多能干細胞上清液中，含量顯著增高，從而獲得大量增殖能力強、高活性及具有良好功能的RPE細胞?！?/p>
獲得類似視網(wǎng)膜自然結(jié)構(gòu)的片狀組織
正常眼內(nèi)的RPE細胞，是緊密連接的單層細胞，只有移植單層RPE細胞才有可能提高其存活率并發(fā)揮功能?；谶@個原因，研究團隊開始利用組織工程的方式，嘗試體外構(gòu)建具有功能的RPE細胞片。
基因整合是指把兩個非同源基因連接起來。愛爾眼科團隊針對視網(wǎng)膜變性疾病展開進一步的研究，從患者的尿液、血液提取體細胞，進行體外擴增培養(yǎng)，并通過非基因整合型的方式進行重編程轉(zhuǎn)化，將患者的尿液、血液來源的細胞逆轉(zhuǎn)為具有自我復制及分化能力的誘導多能干細胞。
“通過研究，對轉(zhuǎn)化成功的尿液、血液來源的誘導多能干細胞，進行傳代純化并通過多能性基因表達、干性蛋白標志物免疫熒光及體外擬胚體試驗等方法進行鑒定，確認產(chǎn)生的誘導多能干細胞具有多向分化的能力?！睈蹱栄劭茖W院助理研究員顧佳寧說，后續(xù)通過3D分化培養(yǎng)方式，用不同的培養(yǎng)基對誘導多能干細胞進行視網(wǎng)膜方向的定向誘導分化，獲得視網(wǎng)膜器官發(fā)育的類似組織。并對其中出現(xiàn)色素表達的細胞，進行分離培養(yǎng)，得到RPE細胞，通過培養(yǎng)形成一層超薄的類似視網(wǎng)膜自然結(jié)構(gòu)的片狀組織。
“但目前尿液及血液細胞的各種重編程方法效率均不高，往往要觀察半個月以上，才能確定是否重編程成功。因此，獲得患者體細胞來源的iPS細胞并不容易?！标惤ㄌK解釋說，對iPS細胞的誘導分化存在多種影響因素，如初始細胞的密度及iPS細胞狀態(tài)等。因此，通過iPS細胞誘導分化得到的RPE細胞色素表達情況不穩(wěn)定，還需進一步控制各個變量，獲得穩(wěn)定分化成優(yōu)質(zhì)RPE細胞的誘導方法。
變角膜透鏡為支架材料
一個成功的RPE細胞片應具備三要素，即種子細胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和支架材料。除了高活性的種子細胞外，支架材料可有效保證細胞的黏附性，以及在移植時可確保細胞以正確的方向面對光感受器細胞。于是，研究團隊把全飛秒激光近視手術(shù)中切下取出的角膜基質(zhì)透鏡“變廢為寶”，提高了其再利用價值。研究發(fā)現(xiàn)，當RPE細胞接種在角膜基質(zhì)透鏡上，并應用誘導多能干細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，可以使RPE細胞片具有更多的干細胞特性、完善的纖毛組裝以及成熟功能。
此外，團隊還采用3D細胞培養(yǎng)、類器官等新技術(shù)，建立眼遺傳病患者疾病細胞模型，探明眼病發(fā)病和發(fā)展的機制及規(guī)律?；诎l(fā)病機理分析，對現(xiàn)有藥物做出個體化評估，以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和篩選新藥物，獲得眼遺傳病及其他眼病新的治療方案。
“幾十年來，干細胞一直有望治愈疑難雜癥。該項研究將加速推動更安全的誘導多能干細胞療法的發(fā)展，同時，實驗已經(jīng)證明了該項技術(shù)的安全性、有效性，為進行人體臨床試驗提供了充足依據(jù)。”唐仕波說。
